A botulizmus diagnózisa a Clostridium botulinum toxin azonosításán alapul, és a klinikai tünetek megfigyelése, még akkor is, ha néha nem specifikusak. A betegség valójában összekeverhető a Guillain-Barré-szindrómával, a poliomielitissel, a stroke-mal, a myasthenia gravis-val és a kullancsbénulással.
Élelmiszer-botulizmusban a neuromuszkuláris rendellenességek és a potenciálisan szennyezett élelmiszerek lenyelése fontos nyomokat jelent. Egyidejű megnyilvánulás legalább két betegnél, akik ugyanezt az ételt fogyasztották, megkönnyíti a diagnózist. A megerősítést úgy kapjuk meg, hogy a mikroorganizmust izoláljuk a beteg gyanús élelmiszermintáinak vagy ürülékeinek tenyésztési vizsgálatával, valamint az élelmiszerekben vagy biológiai anyagokban (például vérben, gyomornedvben és hányásban) lévő botulinum toxin azonosításával.
A sebbotulizmusban ezzel szemben a szérum toxin diagnózisa vagy a Clostridium botulinum bőrelváltozási mintából történő izolálása ezt megerősíti.
